Low impact to fixed cell processing aiming transmission electron microscopy

In cell culture, cell structures suffer strong impact due to centrifugation during processing for electron microscope observation. In order to minimise this effect, a new protocol was successfully developed. Using conventional reagents and equipments, it took over one week, but cell compression was reduced to none or the lowest deformation possible.

Morphological and morphometrical assessment of spermathecae of Aedes aegypti females

The vectorial capacity of Aedes aegypti is directly influenced by its high reproductive output. Nevertheless, females are restricted to a single mating event, sufficient to acquire enough sperm to fertilize a lifetime supply of eggs. How Ae. aegypti is able to maintain viable spermatozoa remains a mystery. Male spermatozoa are stored within either of two spermathecae that in Ae. aegypti consist of one large and two smaller organs each. In addition, each organ is divided into reservoir, duct and glandular portions. Many aspects of the morphology of the spermatheca in virgin and inseminated Ae. aegypti were investigated here using a combination of light, confocal, electron and scanning microscopes, as well as histochemistry. The abundance of mitochondria and microvilli in spermathecal gland cells is suggestive of a secretory role and results obtained from periodic acid Schiff assays of cell apexes and lumens indicate that gland cells produce and secrete neutral polysaccharides probably related to maintenance of spermatozoa. These new data contribute to our understanding of gamete maintenance in the spermathecae of Ae. aegypti and to an improved general understanding of mosquito reproductive biology.

Mecanismos da ação larvivida do diflubenzuron sobre Aedes aegypti evidenciados pelas alterações ultraestruturais / Mechanisms of the larvicidal effect of diflubenzuron on Aedes aegypti larvae, as evidenced by ultrastructural changes

O dengue é uma doença viral transmitida por Aedes aegypti em mais de 100 países na faixa intertropical do mundo e, até o momento, as principais formas de controle são as ações antivetoriais. Neste trabalho, são apresentadas as alterações ultraestruturais provocadas pelo diflubenzuron (DFB) nas larvas de Ae. aegypti. Os experimentos foram realizados com larvas de terceiro estádio de Ae. aegypti com DFB nas concentrações de 0,1 e de 1miug/mL. Após 24 horas de exposição, as larvasforam coletadas, fixadas, desidratadas, emblocadas, cortadas, contrastadas com acetato de uranila a 3por cento e citrato de chumbo e analisadas em microscópio eletrônico. As alterações ultraestruturaisforam observadas na cutícula e no mesêntero dessas larvas. Por meio de microscopia de varredura, observou-se o aumento do número das cerdas, que se apresentaram mais delgadas e mais longas do que o controle e exibiram um padrão de enrolamento nos sulcos intersegmentares. As análises nomicroscópio eletrônico de transmissão revelaram que as epicutículas antigas se desprenderam quase que totalmente da nova epicutícula e não possuíam pontos de reforço comumente encontrados no controle. As células do mesêntero de larvas expostas ao DFB apresentaram um arcabouço esponjosoe nas secções ultrafinas se apresentaram danificadas e vacuolizadas, mas com a presença de vesículas de secreção e integridade mitocondrial. Este estudo mostrou que o DFB interfere no processo da ecdise e impede a liberação da cutícula velha que se acumula nos espaços intersegmentares estrangulando as porções segmentares num processo sucessivo e acumulativo, também bloqueia a muda e provoca a morte da larva. Este é o mecanismo de ação larvicida do DFB sobre Ae. aegypti,entretanto o produto age também no mesêntero destruindo as células.

Alterações ultraestruturais em larvas de Aedes aegypti submetidas ao diterpeno labdano, isolado de Copaifera reticulata (Leguminosae), e à uma fração rica em taninos de Magonia pubescens (Sapindaceae) / Ultrastructural alterations in larvae of Aedes aegypti subject to labdane diterpene isolated from Copaifera reticulata (Leguminosae) and a fraction enriched with tannins of Magonia pubescens (Sapindaceae)

INTRODUÇÃO: Dengue é um importante problema de saúde pública, em vários países, e tem como principal vetor o Aedes aegypti, mosquito mais adaptado às áreas urbanizadas. Apresenta-se, pela primeira vez, as alterações ultraestruturais em larvas de 3º estádio, desse mosquito, causadas pelos larvicidas naturais, um diterpeno labdano, extraído de Copaifera reticulata, e uma fração rica em taninos catéquicos, extraída de Magonia pubescens, evidenciando o mecanismo de ação dessas substâncias. MÉTODOS: Os experimentos foram realizados com larvas de 3º estádio em solução de 0,9ppm, do diterpeno (3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-óico) e de 3,7ppm, da fração majoritária de tanino catéquico de massa molecular 864Da. Obtiveram-se as substâncias através de fracionamentos cromatográficos sucessivos, identificadas por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas. As larvas que atingiram estado letárgico foram coletadas e dissecadas e seus tubos digestórios fixados, desidratados, emblocados e polimerizados. Cortes ultrafinos foram feitos e contrastados com acetato de uranila 3 por cento e citrato de chumbo, posteriormente, levados ao microscópio eletrônico. RESULTADOS: As principais alterações ultraestruturais provocadas pelos diterpeno e tanino sobre larvas de Aedes aegypti foram vacuolização citoplasmática, desorganização e degeneração celular, mudança estrutural dos microvilos e deslocamento das células da lâmina basal. CONCLUSÕES: O diterpeno e a fração rica em taninos catéquicos provocaram a morte das larvas de Aedes aegypti através da destruição celular no intestino médio.

INTRODUCTION: Dengue is an important public health problem in many countries and its main vector Aedes aegypti, is the mosquito most adapted to urban areas. For the first time, the mechanism of action of labdane diterpenoid extracted from Copaifera reticulata and the fraction enriched of catechin tannins extracted from Magonia pubescens is demonstrated through ultrastructural alterations of Aedes aegypti larvae. METHODS: Experiments were performed using a 0.9ppm solution of diterpenoid and 3.7ppm of the fraction as the main catechin tannin of molecular mass 846Da. The compounds were obtained by thin layer chromatography and identified by nuclear magnetic resonance of hydrogen and mass spectrometry. Larvae that achieved lethargic state were collected and dissected. Next, they were contrasted with 1 percent uranyl acetate, dehydrated, embedded and polymerized. Ultrathin sections were made, mixed with 3 percent uranyl acetate and lead citrate and placed in an electron microscope. RESULTS: The main ultrastructural alterations caused by the diterpenoid and by tanins in larvae of Aedes aegypti were: cytoplasmic vacuolation, alteration of microvilli, cellular aging, cell disruption and degeneration, formation of secretion vesicles and structural changes in microvilli, irregular nuclei and displacement of cells in the basal lamina. CONCLUSIONS: The fraction containing tannins and the diterpenoid caused the death of Aedes aegypti larvae by cell destruction in the midgut.

Morfología y citoquímica de cultivos celulares de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) y susceptibilidad a Leishmania panamensis (Kinetoplastida: Trypanosomatidae)

Morphology and cytochemistry of Aedes aegypti’s cell cultures (Diptera: Culicidae) and susceptibility to Leishmania panamensis (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). The first cellular line of Aedes aegypti was developed by Grace in 1966; afterwards, other cellular lines of this species have been generated. These have been used for the study of pathogenic organisms like viruses, bacteria and parasites, which demonstrates their importance in biomedical applications. This research describes, for the first time, some cytochemical characteristics of A. aegypti cell cultures, that were infected with (MHOM/CO/87CL412) strain of Leishmania panamensis. A morphological study of the cell culture was also carried out. Maintenance of the cell culture, parasites and infection in vitro were carried out in the Laboratory of Entomology, Cell Biology and Genetics of the Universidad de La Salle. The cell cultures infected with the parasite were maintained in a mixture of mediums Grace/L15, supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS) at pH 6.8 and a temperature of 26 ºC, during 3, 6 and 9 post-infection days. After this, these cell cultures were processed through High Resolution Light Microscopy (HRLM) and Transmission Electron Microscopy (TEM) based on standard protocols defined by the Group of Microscopy and Image Analyses of the Instituto Nacional de Salud. Semi-fine slices of 1 µm colored with toluidine blue were used for the morphological analysis of the culture, and ultra fine cuts of 60 to 90 nm stained with uranyl acetate and lead citrate where used for the ultrastructural study. In addition, PAS and peroxidase staining was carried out in cells fixed with methanol. The morphometric study was analyzed with software ImageJ (NIH). In the semi-fine slices, small cells were observed showing fibroblastic appearance 10.84±2.54 µm in length and 5.31±1.26 µm wide; other cells had epithelial appearance with a great peripheral nucleus, voluminous and vacuolated cytoplasm, 23.04±4,00 µm in length and 13.96±3.70 µm wide. These last ones predominated over the ones with fibroblastic appearance. Regarding the PAS coloration, 7.08 % of the cells presented abundant PAS positive cytoplasmatic granules which indicated polysaccharides presence. The peroxidase test gave a negative result. The greatest percentage of infection (18.90 %) of one total of 101 cells, turned up by day 6. Some cells analyzed by TEM presented a vacuolated aspect cytoplasm; some contained parasites, other fibrillar material and others were empty. The results indicate that A. aegypti cell culture can support the internalization and transformation of the parasite, which demonstrates the capacity that these cell cultures have to be infected with L. panamensis and to maintain the infection for approximately one week. Rev. Biol. Trop. 56 (2): 447-458. Epub 2008 June 30.

La primera línea celular de Aedes aegypti fue establecida por Grace en 1966 y desde entonces se han utilizado para el estudio de virus, bacterias y parásitos. En el presente trabajo se describen, por primera vez, algunas características citoquímicas de los cultivos celulares de A. aegypti, infectados con la cepa (MHOM/CO/87CL412) de Leishmania panamensis. También se realizó un estudio morfológico de las células del cultivo. Se observaron 30 células pequeñas con apariencia fibrolastoide de 10.84±2.54 µm de largo y 5.31±1.26 µm de ancho; otras 30 presentaron apariencia epitelioide con 23.04±4.00 µm de largo y 13.96±3.70 µm de ancho; éstas últimas predominaron sobre las de apariencia fibroblastoide. De 113 células, un 7.08%, presentaron abundantes gránulos citoplasmáticos positivos con la coloración de PAS, indicando presencia de polisacáridos. La prueba de peroxidasa dio un resultado negativo. El mayor porcentaje de infección (18.90%), de un total de 101 células, se presentó el día 6. Ultraestructuralmente, las células presentaron un citoplasma con aspecto vacuolado; algunas contenían parásitos, otras material fibrilar y otras estaban vacías. Los resultados indican que los cultivos celulares de A. aegypti pueden ser infectados por L. panamensis y mantener dicho proceso por aproximadamente una semana.

Scanning electron microscopy of damage caused by Mesocyclops thermocyclopoides (Copepoda: Cyclopoidea) on larvae of the Dengue fever vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

Dengue fever is a mosquito-borne viral disease, whose main biological vector is Aedes aegypti. This mosquito colonizes tropical areas where the disease is endemic. The most obvious action against dengue is attacking its vector. Biological control appears to be an alternative approach, using natural enemies of the mosquitoes, such as predatory copepods. Thus, the morphological study of the damage caused by copepods is important to understand its predatory capacity. Twenty-five A. aegypti larvae were exposed to the copepod Mesocyclops thermocyclopoides and the damage caused by the copepods was evaluated using scanning electron microscopy. The larvae showed damage mainly at the anal segment, the siphon and the abdomen; only three attacks to the head were observed. The size of the siphon might be of importance in determining whether or not a copepod will attack a mosquito larva.

El dengue es una enfermedad viral transmitida por mosquitos, cuyo principal vector es Aedes aegypti. Este mosquito coloniza muchas áreas tropicales donde la enfermedad es endémica. La acción más obvia contra el dengue es el ataque a su vector. El control biológico parece una buena alternativa, empleando enemigos naturales de los mosquitos, como los copépodos. Por lo tanto, es importante el estudio morfológico del daño causado por los copépodos para comprender su capacidad depredadora. Veinticinco larvas de A. aegypti fueron expuestas a la actividad depredadora del copépodo Mesocyclops thermocyclopoides. Mediante microscopia electrónica de rastreo se evaluó el daño causado por los copépodos. Éstos atacaron principalmente el segmento anal, el sifón y el abdomen de las larvas; sólo vimos tres ataques a la cabeza. El tamaño del sifón podría ser de importancia para predecir si los copépodos pudiesen atacar larvas de determinado mosquito.

Scanning electron microscopy of the four larval instars of the Dengue fever vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

Aedes aegypti is the main insect vector of Dengue fever and dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome and represents the only vulnerable element in the control of this disease. Therefore, the identification and quantification of this mosquito is an important task; however, the majority of taxonomic keys are based on the 4th larval instar. For that reason, this study describes the four larval instars ofA. aegypti using scanning electron microscopy. Morphological changes during larval development were observed at the pecten, comb scales and the ventral brush of the abdominal segment X; however, the 3rd and 4th instars showed similar structures with only a slight variation. The structures described in this study will be helpful in the identification of the four instars of A. aegypti, a fundamental task for comprehending the natural history of dengue mainly in new territories affected.

Aedes aegypti es el principal insecto vector de la fiebre del dengue y del dengue hemorrágico/síndrome del choque por dengue y es el único elemento atacable para el control de esta virosis. La identificación y cuantificación de éste es una tarea importante; no obstante, la mayoría de las llaves taxonómicas se basan en el cuarto estadio larval. Por esta razón, en este trabajo se describen los cuatro estadios larvales de A. aegypti los cuales fueron examinados mediante microscopia electrónica de rastreo. Los cambios morfológicos ocurridos durante el desarrollo larval fueron observados en el pecten, las escamas del peine, el cepillo ventral del décimo segmento. El 3ero y 4to estadios larvales mostraron estructuras similares con sólo ligeras variaciones. Las estructuras descritas en este artículo permiten identificar cualquiera de los cuatro estadios larvales de A. aegypti, lo cual representa una tarea importante en la comprensión de la historia natural del dengue en los nuevos territorios afectados.

Epidemiologia molecular do Aedes albopictus (Díptera: Culicidae) / Molecular epidemiology of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)

O objetivo deste estudo foi caracterizar a estrutura genética de populações naturais de Ae. albopictus coletadas na Região Metropolitana do Recife, no Rio de Janeiro e Minas Gerais e avaliar o seu papel como possível vetor na transmissão do Dengue. Para a análise de variabilidade genética foram utilizados dois genes do DNA mitocondrial: citocromo c oxidase II (COII) e nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase subunidade 4 (ND4). Nesta análise utilizando a técnica de SSCP foi identificado um total de oito haplótipos para o gene COII em 252 amostras analisadas e onze haplótipos para o gene ND4 em um total de 273 amostras. Os resultados sobre a análise da variância molecular (AMOVA) para ambos os genes sugeriram que essas populações estão sob forte influência da deriva genética, pois foi identificada uma alta diferenciação genética entre essas populações. Os resultados mostraram que as populações provenientes do município de Moreno foram as mais polimórficas para os dois genes, pois identificamos nestas populações a maioria dos haplótipos encontrados. O município de Moreno é circundado por uma área de mata onde podem existir populações de Ae. albopictus com uma alta variabilidade genética. As populações do Rio de Janeiro e Minas Gerais foram consideradas idênticas, pois apresentaram os mesmos haplótipos para o gene ND4. A análise do DNA mitocondrial associado à técnica de SSCP, constitui uma ferramenta eficiente na caracterização da estrutura genética de populações naturais. Este marcador também poderá ser útil na epidemiologia molecular para traçar rotas de dispersão desta espécie e monitorar o impacto das intervenções dos programas de controle de uma maneira rápida e precisa. Com a finalidade de investigar o envolvimento deste culicídeo na transmissão do vírus dengue foram coletados espécimes de Ae. albopictus em áreas randômicas e em residências onde foram relatados casos com suspeita de Dengue. Estas amostras foram testadas por RT-PCR e isolamento viral em culturas de células C6/36. Dos 217 pools de Ae. aegypti e Ae. albopictus testados para a detecção do vírus Dengue na técnica de RTPCR, 10 pools foram positivos. Destes, 9 pools foram de Ae. aegypti e apenas um pool de Ae. albopictus proveniente do município de Moreno contendo 2 fêmeas coletadas na fase adulta.